Окрашивание эндоспор — это дифференциальный метод окрашивания, используемый для визуализации бактериальных эндоспор под микроскопом. Эндоспоры — это спящие, жесткие, невоспроизводимые структуры, которые производятся некоторыми видами бактерий в типе Firmicutes в ответ на суровые условия окружающей среды. Образование эндоспор позволяет бактериям переживать стрессы, такие как нехватка питательных веществ, высыхание, экстремальные температуры и УФ-излучение. Когда возвращаются благоприятные условия, эндоспоры могут реактивировать метаболизм и подвергаться прорастанию, образуя вегетативные бактериальные клетки.
Процедура окрашивания эндоспор включает использование двух красителей — основного малахитового зеленого и контрастного сафранина или фуксина. Малахитовый зеленый может проникать через жесткую оболочку эндоспор и окрашивать содержимое эндоспор в зеленый цвет. Сафранин/фуксин окрашивает вегетативные бактериальные клетки в розовый цвет, но не может проникать в эндоспоры. Это дифференциальное окрашивание позволяет визуализировать зеленые эндоспоры, четко контрастирующие с розовыми вегетативными клетками под микроскопом.
Процедура окрашивания эндоспор включает следующие этапы:
| Шаг | Процедура |
|---|---|
| 1 | Поместите мазок, содержащий бактерии, образующие эндоспоры, на предметное стекло микроскопа и зафиксируйте его нагреванием. |
| 2 | Залейте предметное стекло первичным красителем малахитовым зеленым и пропарьте на водяной бане или в паровой стойке в течение 5 минут. Это позволяет красителю проникнуть в эндоспоры. |
| 3 | Смойте излишки малахитового зеленого водой. |
| 4 | Проведите контрастное окрашивание сафранином или фуксином в течение 1 минуты. Это окрашивает вегетативные клетки в розовый цвет. |
| 5 | Смойте излишки контрастного окрашивания водой и промокните насухо. |
| 6 | Изучите предметное стекло под микроскопом с помощью иммерсионной масляной линзы. |
Малахитовый зеленый проникает и окрашивает эндоспоры в зеленый цвет, в то время как вегетативные клетки подхватывают контрастное окрашивание сафранином/фуксином и становятся розовыми. Это обеспечивает контраст для визуализации эндоспор на фоне вегетативных бактерий.
Эндоспоры имеют сложную многослойную структуру, которая делает их устойчивыми к пятнам и красителям. Слои включают:
Оболочка эндоспоры и слои кортекса содержат специализированные спороспецифичные белки, которые обеспечивают устойчивость к теплу, радиации, химикатам и проникновению пятен. Небольшие молекулы могут медленно диффундировать через оболочку. При достаточном времени малахитовый зеленый может проникнуть через оболочку и окрасить ядро.
Малахитовый зеленый является основным красителем, используемым в процедуре окрашивания эндоспор. Это основной краситель, который окрашивает бактериальные эндоспоры в зеленый цвет. Основные характеристики малахитового зеленого:
Нагревание малахитового зеленого способствует диффузии через слои эндоспор. Обработка паром в течение 5 минут позволяет ему полностью проникнуть в ядро и прочно связать содержимое эндоспор. Промывание позволяет избавиться от излишков краски, не удерживаемых внутри споры.
В качестве контр-окрашивания в процедуре эндоспор используются сафраниновые или фуксиновые красные красители. Характеристики:
Этап контр-окрашивания быстрый, всего 1 минута. Это окрашивает все присутствующие вегетативные клетки, в то время как эндоспоры остаются зелеными.
После процедуры окрашивания эндоспор:
Это обеспечивает контраст для четкой визуализации ярко-зеленых эндоспор на фоне розовых вегетативных бактерий. Эндоспоры выделяются из-за разницы в цвете.
Зеленый цвет указывает на присутствие эндоспор и подтверждает, что малахитовый зеленый краситель проник в многослойную оболочку эндоспор и кортекс. Эндоспоры, которые не окрашиваются малахитовым зеленым, могут не иметь должным образом сформированных защитных слоев.
Некоторые примеры бактерий, образующих эндоспоры, и ожидаемые результаты окрашивания эндоспор:
| Бактерии | Локализация эндоспор | Цвет эндоспор после окрашивания |
|---|---|---|
| Bacillus subtilis | Центральный, овальный | Зеленый |
| Bacillus megaterium | Центральный, овальный | Зеленый |
| Clostridium perfringens | Субтерминальный, круглый | Зеленый |
| Clostridium tetani | Терминальный, круглый | Зеленый |
У всех этих видов эндоспоры должны окрашиваться в зеленый цвет, а вегетативные клетки — в розовый после процедуры окрашивания эндоспор. Это подтверждает правильную морфологию эндоспор и поглощение красителя.
Метод окрашивания эндоспор имеет следующие применения:
Окрашивание эндоспор является важным диагностическим инструментом, четко отличая эндоспоры от вегетативных клеток. Он также помогает в морфологическом анализе и биологических исследованиях бактерий, образующих эндоспоры.
Процедура окрашивания эндоспор использует малахитовый зеленый для избирательного окрашивания эндоспор в зеленый цвет, а затем сафраниновое контрастное окрашивание для маркировки вегетативных клеток в розовый цвет. Этот дифференциальный метод окрашивания позволяет четко визуализировать зеленые бактериальные эндоспоры на розовом фоне вегетативных клеток.
После протокола окрашивания эндоспоры должны выглядеть зелеными, что указывает на проникновение малахитового зеленого в оболочку и кортекс и его связывание с содержимым эндоспор, таким как нуклеиновые кислоты и ферменты. Зеленый цвет подтверждает идентичность эндоспор и проверяет их устойчивость к неблагоприятным условиям и окрашиваниям. Он позволяет их обнаруживать, подсчитывать и локализовать в бактериальных мазках и культурах.
Подводя итог, можно сказать, что в конце процедуры окрашивания эндоспор эндоспоры окрашиваются в зеленый цвет, а вегетативные бактерии — в розовый. Это характерное дифференциальное окрашивание является ключом к идентификации эндоспор и изучению эндоспорообразующих бактерий, таких как Bacillus и Clostridium, под микроскопом.