Окрашивание по Граму — это дифференциальный метод окрашивания, используемый для классификации бактерий на две большие группы на основе физических свойств их клеточных стенок. Процесс окрашивания по Граму включает окрашивание бактерий кристаллическим фиолетовым красителем, затем обработку раствором йода, затем обесцвечивание и, наконец, контрастное окрашивание. В зависимости от структуры клеточной стенки бактерии либо сохраняют кристаллический фиолетовый краситель (грамположительные), либо теряют кристаллический фиолетовый краситель и принимают цвет контрастного окрашивания (грамотрицательные). Заключение по окрашиванию по Граму дает информацию о широкой классификации видов бактерий, которая может помочь в диагностике и лечении бактериальных инфекций.
Окрашивание по Граму основано на различных свойствах грамположительных и грамотрицательных клеточных стенок. Грамположительные бактерии имеют толстый слой пептидогликана в своей клеточной стенке, который удерживает кристаллический фиолетовый краситель во время этапа обесцвечивания. Грамотрицательные бактерии имеют более тонкий слой пептидогликана и внешнюю мембрану, содержащую липополисахарид, который не удерживает кристаллический фиолетовый краситель во время обесцвечивания.
Этапы процедуры окрашивания по Граму следующие:
Первичный краситель кристаллическим фиолетовым красителем наносится на мазок бактерий на предметном стекле микроскопа. Кристаллический фиолетовый проникает через пористые области клеточных стенок как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий.
Добавляется раствор йода, который действует как протрава для фиксации кристаллического фиолетового красителя внутри клетки. Йод образует комплекс с кристаллическим фиолетовым.
Для смывания излишков краски используется обесцвечивающий агент, такой как этанол или ацетон. У грамотрицательных бактерий комплекс кристаллического фиолетового йода вытекает из внешней мембраны, оставляя клетки бесцветными. У грамположительных бактерий толстый слой пептидогликана препятствует удалению красителя.
Применяется вторичный контр-краситель, такой как сафранин, который окрашивает обесцвеченные грамотрицательные клетки в розовый или красный цвет. Грамположительные клетки остаются фиолетовыми из-за задержки красителя кристаллического фиолетового.
Основное различие между грамположительными и грамотрицательными бактериями заключается в структуре их клеточных стенок:
| Грамположительные | Грамотрицательные |
|---|---|
| Толстый слой пептидогликана (50-90% клеточной стенки) | Тонкий слой пептидогликана (5-10% клеточной стенки) |
| Присутствуют тейхоевые кислоты | Внешняя мембрана содержит липополисахарид |
| Внешняя мембрана отсутствует | Периплазматическое пространство между внутренней и внешней мембраной |
Толстый слой пептидогликана грамположительных бактерий сохраняет кристаллический фиолетовый краситель даже после обесцвечивания. Тонкий слой пептидогликана грамотрицательных бактерий не может сохранять кристаллический фиолетовый краситель после обесцвечивания.
Окрашивание по Граму предоставляет врачам немедленную полезную информацию о неизвестных бактериальных образцах. Оно может сузить круг идентичности патогена и направить подходы к лечению до окончательной идентификации вида. Некоторые ключевые клинические приложения включают:
– Различение грамположительных и грамотрицательных причин инфекции для руководства антибактериальной терапией
– Выявление наличия бактерий в обычно стерильных жидкостях, таких как кровь, спинномозговая жидкость или суставная жидкость, что указывает на инфекцию
– Диагностика источников инфекции по образцам, таким как мокрота, раны, моча и т. д. Наличие грамположительных диплококков в мокроте предполагает пневмонию, вызванную Streptococcus pneumoniae.
– Мониторинг реакции на антибиотики – если применимо, грамположительные или грамотрицательные бактерии сохраняются после лечения, может присутствовать устойчивость к антибиотикам
– Скрининг на наличие определенных патогенов, таких как стрептококк группы B у беременных женщин
Хотя окраска по Граму дает быстрый обзор потенциальных патогенов, у нее есть некоторые ограничения:
– Она не может окончательно идентифицировать виды бактерий – необходимы дальнейшие биохимические исследования required
– Некоторые бактерии могут казаться грамовариабельными, непоследовательно сохраняя или теряя краситель
– Для этой методики требуется опытный микробиолог для точного выполнения окрашивания и интерпретации результатов
– Небактериальные патогены, такие как вирусы и грибки, не будут обнаружены
– Жизнеспособные, но некультивируемые бактерии могут сохранять окраску, даже если клетки мертвы
– Ошибки могут возникать из-за таких факторов, как плохое окрашивание, избыточное обесцвечивание или нечеткая морфология
Окрашивание по Граму обеспечивает быстрый и недорогой метод классификации бактерий как грамположительных или грамотрицательных на основе свойств структуры их клеточной стенки. Краситель кристаллический фиолетовый сохраняется в грамположительных бактериях с толстым слоем пептидогликана, но не в грамотрицательных бактериях с более тонким слоем пептидогликана и внешней мембраной. Заключение окраски по Граму дает клиницистам ключевую предварительную информацию о потенциальных патогенах, чтобы помочь в диагностике и эмпирическом лечении, пока ожидаются окончательные результаты культуры. Тем не менее, для идентификации конкретных видов и восприимчивости к противомикробным препаратам по-прежнему требуются дополнительные исследования. При правильном выполнении и интерпретации окраска по Граму остается одним из самых полезных инструментов в клинической микробиологии.