Флуоресценция — это явление, при котором определенные молекулы испускают свет после возбуждения электромагнитным излучением. Флуоресцеинизотиоцианат, также известный как ФИТЦ, — популярный флуоресцентный маркер, используемый в биологических и биомедицинских исследованиях.
Флуоресценция возникает, когда молекула поглощает свет на определенной длине волны, а затем испускает свет на более длинной длине волны. Поглощенные и испускаемые длины волн известны как длины волн возбуждения и испускания соответственно.
Процесс происходит в три этапа:
Разница между поглощенной и испускаемой длинами волн известна как сдвиг Стокса. Этот сдвиг позволяет детектировать испускаемый свет отдельно от возбуждающего света.
FITC (C21H11NO5S) является производным флуоресцеина, естественной флуоресцентной молекулы, встречающейся во многих растениях, животных и микроорганизмах. FITC обладает следующими основными свойствами:
Реактивная группа изотиоцианата (-N=C=S) позволяет FITC связываться с белками и другими биомолекулами. Это делает его полезным для флуоресцентной маркировки и отслеживания в биологических системах.
Некоторые основные приложения FITC включают:
FITC обычно конъюгируют с антителами для визуализации их связывания со специфическими целевыми антигенами с помощью флуоресцентной микроскопии. Этот метод известен как иммунофлуоресценция. Он позволяет исследователям определять экспрессию и локализацию белков в фиксированных клетках и тканях.
В проточной цитометрии клетки в суспензии пропускаются через лазерный луч. Меченые FITC антитела, связанные с антигенами клеточной поверхности, флуоресцируют при прохождении через луч, предоставляя количественные данные об экспрессии антигена. Это полезно для фенотипирования популяций клеток.
FITC обеспечивает флуоресцентное обнаружение и отслеживание белков во время биохимических анализов и проб. Его также можно использовать для маркировки внутриклеточных белков в живых клетках посредством микроинъекции или электропорации.
FITC интеркалирует между парами оснований ДНК и связывается с РНК. Он используется для маркировки и визуализации нуклеиновых кислот в таких приложениях, как флуоресцентная гибридизация in situ (FISH).
FITC используется для мониторинга пролиферации клеток путем ковалентного связывания его с компонентами клеточной мембраны. По мере деления клеток FITC распределяется между дочерними клетками и может быть количественно определен с помощью проточной цитометрии.
Изотиоцианатная (-N=C=S) группа FITC легко реагирует с первичными аминами (-NH2) на белках и других биомолекулах, образуя стабильные тиомочевинные связи. Это обеспечивает целевой способ флуоресцентной маркировки определенных молекул. Реакция происходит оптимально при pH 9-10.
Например, FITC обычно конъюгируется с антителами путем реакции с остатками лизина или фрагментами антител, такими как F(ab')2:
Каждая молекула FITC содержит одну изотиоцианатную группу, ограничивая замену до ~1-2 молекул FITC на антитело. Более высокие уровни маркировки могут снизить растворимость и специфичность.
FITC является одним из многих флуорофоров, используемых в биологических исследованиях и биотехнологии. Вот некоторые часто используемые альтернативы:
| Флуорофор | Макс. возбуждение (нм) | Макс. эмиссия (нм) | Основные характеристики |
|---|---|---|---|
| FITC | 495 | 519 | – Высокая поглощательная способность – Хороший квантовый выход – Универсальная маркировка |
| TRITC | 548 | 572 | – Смещен в красную область – Низкий фон |
| Alexa Fluor 488 | 495 | 519 | – Фотостабильный – Высокий квантовый выход |
| GFP | 395 | 509 | – Генетически кодируемый – Визуализация живых клеток |
В то время как другие флуорофоры могут иметь преимущества, FITC по-прежнему широко используется из-за своей универсальности, доступности и долгой истории в биологических исследованиях.
При работе с FITC для экспериментов по флуоресцентной маркировке есть несколько важных соображений:
Некоторые проблемы, связанные с использованием FITC, включают:
Эти потенциальные недостатки должны контролироваться в тщательно спланированных экспериментах. Новые альтернативные красители, такие как Alexa Fluor, преодолевают некоторые ограничения FITC.
Подводя итог, можно сказать, что FITC является универсальной и широко используемой флуоресцентной меткой в биологических исследованиях и тестировании. Ее реактивная изотиоцианатная группа обеспечивает простой способ флуоресцентной маркировки белков, антител, нуклеиновых кислот и других биомолекул. При конъюгации и правильном использовании она обеспечивает чувствительное флуоресцентное обнаружение и визуализацию биологических образцов с помощью микроскопии, проточной цитометрии и других методов. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы оптимизировать условия маркировки и учитывать чувствительность флуоресценции FITC к окружающей среде. В целом, FITC остается полезным инструментом для флуоресцентных приложений, несмотря на некоторые ограничения.